化学品在咱们日常生存中应用相等过去巨乳 露出，现在工业化生产大多是遴选化学法合成，但是化学法合成存在环境浑浊大和催化要求严苛等收尾要求。近些年来，越来越多的生物学家尝试利用生物法合成化学品，但是由于一些化学品结构较为复杂，常常需要多酶级联催化低价易得底物合成蓄意化学品。是以，系统性地追忆多酶级联反馈的构建计策显得尤为必要。同期，为了进一步地了解现在多酶级联催化合成化学品的商量近况和骨子应用情况，本文勾搭本课题组的一些商量标的和责任，汇报了多酶级联催化反馈体系在6种双官能团功能化学品，包括ω-氨基脂肪酸、烷基内酰胺、α， ω-二元羧酸、α， ω-二胺、α， ω-二醇、ω-氨基醇合成中的应用。

1 多酶级联反馈

多酶级联反馈是指将两种致使更多的酶勾搭起来生产蓄意化合物[1-4]，这种步调已被阐明故意于提高原子效劳、幸免不沉稳或有毒的中间体、无需中间产物分离提真金不怕火和减少溶剂破钞和废料生成量，能最大化地检朴反馈器体积与反馈时刻[5-7]，或然还能达成化学催化无法达成的反馈[3， 8]。

1.1 多酶级联反馈的类型

笔据反馈环境的不同，可分为体内、体外和羼杂级联反馈[9-10] (图 1)。体外级联反馈是以纯酶、冻干酶粉、粗酶液等催化剂体式进行反馈，其操作较为绵薄，便于对反馈参数进行赞成和优化，时空产率相对更高[11]，其应用已相等过去。最典型的例子是2015年笔者场所课题组[12]和曼彻斯特大学Turner团队[13]险些同期发表的双酶借氢级联法由醇制胺新途径，该途径依赖醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase， ADH)和胺脱氢酶(amine dehydrogenase， AmDH)的串联操作，使好多不同结构的芳醇醇和脂肪醇大要达成一锅胺化，况兼得到高达97%的振荡率和99% ee的对映体采纳性。这种辅因子自给型氧化规复级联反馈具有很高的原子经济性，只需用铵盐当作氨基供体，而且产生的独一副产物是水，产物分离大大简化。联系于体外级联，体内多酶级联反馈是构建东说念主工细胞工场，将所需要的元件酶在细胞内进行共抒发，其优点在于无需单独添加所需的元件酶，可减少发酵和酶制备的老本；同期在胞内的酶沉稳性更高，可利用胞内自己的辅因子再生系统。现在已有多个体内多酶级联反馈顺利应用的案例[14-18]，举例以甘氨酸和醛为底物合成α-官能化有机酸[14]以及烯烃的氧化和氨基官能化[16]。但是体内级联方式也存在一些漏洞，如胞内的代谢聚积过于复杂，扰乱因素较多，难以精确调控；多个基因共抒发操作设施繁琐，且多个基因在单细胞内共抒发会导致代谢包袱过大、抒发效果差，使得最终合成的时空产率相对更低。为了勾搭体外级联反馈和体内级联反馈的优点，同期幸免两者的漏洞，2018年，新加坡国立大学Liu等[19]提议了遴选整细胞与无细胞提真金不怕火液进行偶联反馈的新办法，通过抒发醇脱氢酶和NAD(P)H氧化酶的整细胞偶联胺脱氢酶和葡萄糖脱氢酶粗酶液进行一锅级联反馈，将细胞内的NAD+和细胞外的NADH辅因子轮回再生系统互相闭幕，幸免两种辅因子轮回互关系扰以提高其利用效劳。

另一方面，笔据多酶级联催化反馈途径的不同，不错将其分为4类：即线性级联、平行级联、正交级联和轮回级联(图 2)。(1) 线性级联(图 2A)：底物经过一步或一语气多步振荡合成蓄意产物。这种级联途径的上风在于不错幸免有毒、不沉稳和易爆中间体的储存和处理，同期有助于检朴时刻并减少多步合成中间产物分离的设施[20]。另外中间产物鄙人一步反馈的振荡也故意于可逆反馈的均衡出动妥协除中间产物对酶的禁锢。(2) 平行级联(图 2B)：平行级联可能是生物催化氧化规复反馈最常见的级联类型，产物的变成与同期进行的第二个平行反馈相勾搭。一个典型的例子是氧化规复酶依赖的NAD(P)H的辅因子轮回[21]，另一个例子是自给式氢化物穿梭级长入成两种有应用价值的产物[22]。(3) 正交级联(图 2C)：相较于平行级联，此级联方式进一步将副产物振荡为其他无应用价值的产物，但是可进一步促进均衡出动。举例在转氨酶催化反馈中通过引入乳酸脱氢酶/葡萄糖脱氢酶来进一步振荡氨基供体丙氨酸产生的副产物丙酮酸，促使均衡向转氨标的出动[23-24]。(4) 轮回级联(图 2D)：轮回级联的主要特征是生成的产物被振荡为底物。举例，通过转氨酶或胺脱氢酶的去外消旋化，行将外消旋羼杂物振荡为光学纯的单一双映异构体[25-26]。可是在骨子应用中，过去是以蓄意产物为导向的多种不同级联方式的解放组合。

1.2 多酶级联反馈的构建计策

构建级联反馈的计策是“途径瞎想-元件招募-系统测试-重构优化”轮回[10] (图 3)，领先是级联途径瞎想，可笔据当然代谢途径赢得灵感，或通过生物催化逆合要素析来瞎想途径，即笔据蓄意产物和酶的催化功能，逆向分析所需的底物和酶元件；随后，通过筛选赢得所需催化功能的元件酶，同期可通过感性瞎想或者定向进化等步调进一步提高元件酶的催化性能和沉稳性；在细目了元件酶和级联途径后，系统测试分析反馈体系的要求，如温度、pH、辅底物及催化剂浓度等，通过色谱等分析步调测定级联催化过程的底物和产物的浓度变化，商量级联反馈的瓶颈问题，如多酶协同作用、交叉反馈、热力学均衡和中间反馈物对酶的禁锢作用等；临了，在科罚影响级联反馈合座效劳的问题后，为进一步镌汰老本，针对性地对多个不同的元件酶进行共抒发及东说念主工细胞工程的重构，如大肠杆菌(Escherichia coli)菌群构建，用于协同催化合成蓄意产物，并对级联反馈的参数进一步优化，最终科罚瓶颈问题，镌汰催化老本，训诲级联反馈的合收效劳。

1.2.1 途径瞎想

多酶级联途径主如果笔据现存的当然代谢反馈途径或通过逆合要素析进行瞎想。Korman等[27]利用糖酵解和甲羟戊酸途径创建了一个由27种来自于不同物种的元件酶组成的体外酶级联，由葡萄糖合成单萜类化合物，在5 d内柠檬烯和蒎烯的滴度区别为12.5 g/L和14.9 g/L，产率进步88%。这大猛进步了利用全细胞代谢生产柠檬烯滴度的最高记录，阐明了这一体外级联反馈途径的后劲。开辟体外多酶级联的另一种步调是从新构建当然界中不存在的合成途径，利用该步调不错大肆定制合成所需的新式化合物。可是，在莫得现成途径的情况下，瞎想合成蓄意分子的级联反馈可能是一个挑战。在有机合成化学中，过去遴选逆向合成来瞎想蓄意化合物的合成途径。因此，逆向合成意味着从蓄意化合物分子启动，细目要变成的化学键，并相应地细现在体和中间物，该计策一样适用于多酶生物催化反馈。现在，照旧顺利开辟了一些策划器具，如RetroBioCats[28]或myExperiment- RetroPath[29]算法，有助于利用通盘已知的可用的酶催化反馈以及级联途径的瞎想。中国科学院天津工业生物技艺商量所马延和团队顺利构建了包括11步反馈的非自然固碳与淀粉合成途径[30]。具体来说，领先笔据碳原子个数将该途径分为4个不同的模块(C1、C3、C6和Cn模块)；随后在策划途径瞎想软件/网站的指示下，通过采纳和拼装来自31个生物体的62种酶组成11个中枢催化反馈，并将热力学上最故意(∆Gcascade < 0)的多个反馈拼装在一说念；临了优化途径，定向进化瓶颈酶，使淀粉的最终产率达到410 mg/(L·h)。同期，还有多个逆向合成瞎想多酶级长入成新途径的案例，如东说念主类免疫残障病毒(human immunodeficiency virus， HIV)逆转录酶的核苷访佛物和禁锢剂didanosine[31]或islatravir[32]的合成。

1.2.2 元件酶招募

通盘级联反馈的效劳取决于每个元件酶，元件酶既要具有高催化活性和更好的兼容性，又需要保握较强的底物特异性以幸免交叉反馈和副产物的产生，因此赢得得当级联反馈要求的元件酶对通盘级联反馈的成败至关迫切。现在元件酶筛选常用的计策主要有6种(图 4)。

(1) 从泥土微生物中富集培养：通过从泥土微生物中富集培养挖掘所需的元件酶照旧被阐明是一种灵验的计策，在培养基中加入特定的碳源或者氮源筛选具有特定催化功能的菌株，经过几轮扩增培养后，筛选出的菌株进一步用优化的滋长培养基培养，并进行生物催化活性测定实验(图 5)。Shin等[33]商量小组照旧从不同环境的泥土样品中筛选赢得谋稍微生物，并被用于手性拆分外消旋胺，如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis JS64， BtTA)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia JS2F， KpTA)和河流弧菌(Vibrio fluvialis JS17， VfTA)是最早对α-甲基苄胺和仲丁胺进行(S)-采纳性全细胞生物振荡的微生物，其(R)-对映体的产率 > 95%。

(2) 从特定基因组文库挖掘蓄意酶：宏基因组的样品着手相等过去，从深海喷口、海洋名义和火山温泉到共生哺乳动物宿主，以产生特定的功能。宏基因组基因挖掘过去有两种步调：“功能驱动”和“序列驱动”。其中“功能驱动”法已被用于获取可用于工业应用的生物学数据，也照旧有其他工业酶通过“功能驱动”的步调被发现。Yeh等[34]利用此步调发现了沉稳性更高的新式内切葡聚糖酶，Bayer等[35]以肉桂腈等6种不同的腈的羼杂物为底物，从超基因组文库中筛选出新的腈水解酶基因nit1，可用于生产良好化工居品1， 5-二甲基-2-哌啶酮。Ward等[36]利用“序列驱动”的步调从东说念主类宿主口腔共生微生物菌群中发现新的转氨酶基因，具体设施为领先从样品中提真金不怕火DNA，然后利用高通量测序步调进行测序，再使用pfam寂然器具瞩目测度的DNA ω-转氨酶(I型折叠)卵白质，断然完的序列在E. coli BL21中进行异源抒发。在元基因组文库中，异源基因的抒发仍然是断然基因功能的瓶颈。

(3) 基于序列同源性挖掘蓄意酶：跟着测序技艺的发展，多数的基因数据被导入数据库，这使序列比对成为基因挖掘的灵验步调。举例，以转氨酶VfTA为模板进行卵白序列比对，顺利挖掘到了与VfTA同源性38%的着手于紫罗兰色杆菌(Chromobacterium violaceum)的转氨酶CvTA，该酶在转氨催化过程中进展出和模板卵白一样优异的催化性能和后劲[37-38]。以VfTA为先导序列，通过序列比对基因挖掘赢得着手于脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)的转氨酶PdTA，与VfTA同源性为94%，随后利用PdTA和苏氨酸脱氨酶级联将L-苏氨酸(自然)振荡为L-高丙氨酸(非自然)，振荡率高达91%[39]。

(4) 基于特征序列的基因挖掘：基于卵白质的不同进化发源，一些特征序列对酶的催化功能起着要道作用，常用的挖掘计策有不同催化特质的酶多序列比对、进化树分析以及和策划相勾搭分析。以转氨酶为例，尽管(S)-采纳性胺转氨酶[(S)-transaminases， (S)-TAs]已被多数报说念和商量，但(R)-TAs报说念较少。2010年，Höhne等[40]从卵白质拓扑结构、晶体结构和转氨酶眷属的生化信息推断(R)-TAs属于第Ⅳ类折叠，他们的商量假设D-氨基酸鼎新酶(D-amino acid transferase， DAT)、4-氨基-4-脱氧分支酸裂解酶(4-amino-4-deoxybranched acid lyase， ADCL)和L-支链氨基酸氨基鼎新酶(L-branched-chain amino acid transferase， BCAT)在进化上保守的氨基酸残基(或特征序列)基序是(R)-TAs的合理祖宗，于是开辟了一种策划机瞩目算法。该算法仔细分析了多个序列比对的基序，并从搜索的全球数据库中丢弃了诞妄标记的BCAT、DAT和ADCL。利用该步调从大致6 000个酶库中断然出21个(R)-TAs，其中17个酶被实考据实具有活力。采纳7个酶进一步表征，发现它们具有极优异的(R)-采纳性和催化效劳[24]。基于他们的步调，多个商量小组后续又从各式原核生物和真核生物中发现了具有各式胺化和能源学拆分外消旋胺活性的有益基因[41-43]。本课题组通过寻找参与脂肪氧合酶中枢催化功能以及区域采纳性和立体采纳性的保守性残基，如金属勾搭残基(HHHNI)、Coffa位点(异构体手性的决定性位点，(S)-脂氧合酶为Ala，(R)-脂氧合酶为Gly)以及决定异构体位置的残基，筛选到3个脂肪氧合酶，对亚油酸进展出较好的活性，比活性高达73.1 U/mg protein[44]。

(5) 基于卵白结构推断酶的功能：跟着卵白质结构预测步调的发展(如AlphaFold[45]等)，多数未知功能的酶结构被存入卵白质数据库，将这些结构与它们的功能关系起来具有迫切意旨。Höhne等[46]商量了“鸟氨酸氨基鼎新酶(ornithine aminotransferase， OAT)-访佛卵白”集群中功能未知的晶体结构，OAT是依赖于吡哆醛-5′-磷酸(pyridoxal-5′-phosphate， PLP)的酶，属于PLP折叠I类，该眷属中通盘58个可用的3D结构都败清晰相等大的相似性，但它们在活性部位的迫切残基上有所不同，这些残基明显参与底物识别。随后，顺利断然了结构和功能未知的来自硅酸杆菌(Silicibacter pomeroyi， SpTA)、浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides KD131， RsTA)、鲁杰氏菌(Ruegeria sp. TM1040， RsTA)和百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti MAFF30399， MlTA)的4个转氨酶TAs，它们具有过去的底物谱和高的底物特异性，其中SpTA已被过去地应用于多酶级联催化不同底物合成脂肪胺[47-52]。一样，着手于炭疽杆菌(Bacillus anthracis， BaTA)的TA也笔据已报说念的结构用于特定催化丙酮酸盐等多个不同底物[53]。

(6) 利用酶分子工程进一步矫正元件酶：酶的分子工程包括基于立地突变的定向进化、基于序列和结构分析的感性瞎想和两者勾搭的半感性瞎想，已被过去阐明是一种实用而灵验的获取生物催化剂的计策[54]。在多酶级联催化过程中，需要多个酶协同责任，常常某个瓶颈酶就会成为收尾通盘级联反馈效劳的短板，是以亟需对其进行酶分子矫正，以进一步提高档联反馈的合座效劳。Huffman等[32]瞎想的合成核苷访佛物依斯拉韦的级联反馈包括9种酶，其中5种是通过定向进化而赢得的，以乙炔基甘油为原料合成的临了总收率为51% (图 6A)。如Hailes等[55]用平行级联酶促合成苄基异喹啉生物碱，该平行级联瞎想中勾搭了酪氨酸酶、酪氨酸脱羧酶、转氨酶和去甲肾上腺素合成酶。随后发现酪氨酸酶对底物3-F-L-酪氨酸收受度较差，是认为了提高该级联体系中酪氨酸酶对底物的催化活性，对酪氨酸酶进行定向进化矫正，赢得的最优突变体将产率从27%提高至89%。江南大学刘立明等[56]使用绵薄的苯甲醛和丙酮酸当作底物通过酶促-化学级联催化高效生产L-高苯丙氨酸，在筛选元件酶过程中发现苯丙氨酸脱氢酶(phenylalanine dehydrogenase， TiPheDH)为限速酶。因此，对TiPheDH进行矫正以提高其催化效劳(82%)和抒发水平(254%)，并在5 L反馈器中达成L-高苯丙氨酸的高效合成(100.9 g/L， > 99% ee) (图 6B)。2021年，上海交通大学林双君等[57]以4-甲磺酰基苯甲醛为底物，通过偶联转酮醇酶(trans-ketohydrolases， TK)和ω-转氨酶(ω-transaminase， ω-TA)，建筑了一锅法高立体采纳性地合成含两个手性中心的氟苯尼考氨基二醇中间体。通过结构导向的酶分子矫正将TK的对映体采纳性从(S， 93% ee)振荡为(R， 95% ee)，并逆转了转氨酶ATA117的对映采纳性(从ES=9到ER=12)和对酮/醛底物的采纳性，利用矫正后的TK和TA进行级联催化反馈，快播伦理电影达成了(1R， 2R)-对甲磺酰基苯丝氨醇的生物合成(76% yield， 96% de， > 99% ee)。最近，李智等[58]建筑了以SMO-StEH-Aldo-CvTA为催化剂，通过环氧化-水解-氧化-胺化反馈合成(R)-苯酒精胺的级联反馈，通过定向进化矫正瓶颈酶醇氧化酶，使其催化效劳提高了3倍，使得产物(R)-苯酒精胺的滴度达到34.6 mmol/L (> 99% ee) (图 6C)。

1.2.3 系统测试

当多酶级联反馈中的元件酶细目之后，酶的比例和浓度也需要进一步地优化。通过均衡多种不同生物催化剂的活性，不错达成提高通量和减少酶用量。关于级联反馈合成L-丙氨酸，赞成酶的比例不错改善性能和提高产率[59]，通过对缓冲体系和辅因子浓度的进一步优化，赢得了95%以上的产率。另外通过对级联反馈合成2′， 3′-环鸟苷-腺苷一磷酸中4种酶的浓度进行了赞成，使得产物浓度增多了2倍[60]。酶的比例对级联反馈的效劳起着要道作用，影响着大部分的优化蓄意，如振荡率、产量、速度、立体采纳性和热沉稳性等。

尽管酶的催化要求较良善，反馈要求较为访佛，但合成过程中每个设施对最好反馈要求的要求可能存在互异。适用于多酶级联反馈中通盘反馈设施的重迭参数，界说为最优催化要求(图 7)，该参数笔据具体反馈参数和酶种类的不同而变化，该参数的采纳过去是一个挑战，尤其是当级联途径复杂，所波及的中间体、酶元件或辅酶较多的情况下。可供优化的典型参数主要有溶剂系统[37， 61-63]、反馈要素的浓度(底物[64-65]、盐[15， 52， 66]、助溶剂[23， 67]、辅酶[39， 68]、其他添加剂)、缓冲体系的pH值[69-70]、反馈温度[71]，以及辅酶再生系统[72]。如果级联反馈中的多步反馈同期进行的话，很有必要采纳在多个酶反馈的最适要求下进行。值得运道的是，大部分酶是在比较良善要求下进行反馈，比如水溶剂，温度在20–37 ℃之间，pH值在6.0–8.0之间，这也镌汰了其解放度。固然，也有部分酶能耐受更极点的pH值、温度、压力、溶剂和盐浓度等环境[73]。酶具有较高的热沉稳性对合成反馈来说有很大的公正(举例由于较高的工艺温度不错达到较高的活性)，但只要当通盘级联反馈的酶元件热沉稳性都高时才能败清晰昭彰的训诲。同期也需要空洞筹商反馈体系中盐离子对酶的禁锢作用，比如当羧酸规复酶和转氨酶级联振荡脂肪酸合成脂肪胺时，由于羧酸规复酶需要添加二价阳离子Mg2+以提高其催化活性，但是过高的Mg2+浓度对转氨酶有昭彰的禁锢作用[49]。

热力学均衡对级联反馈产率的影响一样不可冷酷，尤其是当级联反馈的临了一步为可逆反馈时，需要提高反馈均衡常数才能激动反馈进行。最典型的例子是波及转氨酶的级联反馈，常用的均衡出动计策主如果“推”和“拉”[74]。“推”指的是添加过量的辅底物，如转氨酶催化反馈中过去需要添加过量的氨基供体，同期也需要预防过量的氨基供体对转氨酶的酶活可能会存在禁锢作用[75]；“拉”主要指产物移除或副产物移除，如本课题组利用阳离子交换树脂吸附产物(R)-苯基甘氨醇以提高档联产率[76]，或通过偶联振荡副产物丙酮酸的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase， LDH)[24， 77-78]或用于丙氨酸氨基供体轮回的丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase， AlaDH)[79-80]以进一步镌汰副产物浓度。

1.2.4 重构优化

与无细胞催化剂比较，构建体内多酶级联(构建细胞工场)系统优点昭彰，无需单独添加所需的各式酶元件，只需添加一个全细胞当作催化剂，操作设施更绵薄，老本镌汰[81-82]。同期，细胞内酶的沉稳性更高，不错幸免酶的纯化、添加辅因子等繁琐费劲的设施[10]。如Turner等[83]在前期多酶级联责任的基础上，进一步将该级联反馈中的4个中枢酶，在10种不同的载体上进行共抒发，顺利筛选得到一个四酶共抒发体系的产率最高，用于催化5个不同的酮酸底物合成哌啶，振荡率为57%，其中对映体过量ee值高达93% (图 8)。随后，作家笔据级联过程中中间产物的积蓄情况，判断每个元件酶的酶活，细目ω-转氨酶为收尾性酶，并利用基因复制计策共抒发了2次ω-转氨酶，使得胺产量大幅增多，最高达93%[84]。

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可是，当级联途径中酶的数目进步4个时，如果将这些酶在归并个细胞中进行共抒发，会导致细胞代谢包袱过大和氧化规复叛逆衡等问题[85]，从而使得部分酶弗成正常抒发或者抒发量很低，从而影响最终的产率。多数商量已尝试构建东说念主工全细胞菌群[14， 16， 48， 52]，行将复杂的级联反馈分为多个具有不同功能的模块，归并个模块所需的酶基因在一个细胞中共抒发，然后多个细胞菌群一说念协同高效催化合成具有高附加值的化学品。菌群模块化构建原则包括以下几点：(1) 每个细胞模块呈现氧化规复中性，如辅酶轮回在一个细胞中；(2) 幸免不同菌群中辅酶的扰乱；(3) 减少卵白质抒发包袱，以确保每个酶都能正常抒发；(4) 每个菌群单干明确。

江南大学刘立明团队构建了多模块菌群催化平台，用于由绵薄的非手性甘氨酸和醛类合成α-氨基酸和α-羟基酸[14] (图 9)。作家瞎想的4个不同的功能化模块：基础模块(basic module， BM)包含苏氨酸醛缩酶和苏氨酸脱氨酶，用于催化底物甘氨酸和醛类合成对应的酮酸；扩张模块1 (extension modules 1， EM1)包含L-或D-羟基异己酸脱氢酶和甲酸脱氢酶用于将α-酮酸规复为α-羟基酸；扩张模块2 (EM2)包含L-氨基酸脱氢酶和甲酸脱氢酶，用于将α-酮酸规复为L-α-氨基酸；扩张模块3 (EM3)包含D-氨基酸转氨酶、甲酸脱氢酶、谷氨酸消旋酶和谷氨酸脱氢酶用于将α-酮酸转氨成D-α-氨基酸。随后，通过级联BM与EM1模块以重置手性-OH合成手性的α-羟基酸，级联BM和EM2或EM3重置手性-NH2用于合成手性α-氨基酸。在顺利招募到各个模块所需的高效特异性元件酶后，对其中的收尾性酶苏氨酸脱氨酶进行分子矫正，使其活力提高了18倍。再将单个模块的通盘酶在一个质粒中共抒发，中式了4种兼容且具有不同抗性的质粒，共构建了64种不同的组合，筛选生产率最高的菌群组合体式。最终顺利应用于催化9种不同的醛，包括芳醇族、杂芳族、杂环族和脂肪族醛，高效合成45种不同的产物[α-酮酸、不同手性的α-羟基酸和α-氨基酸(R， S)]，并将体系进一步扩大至100 mL限制，进而对7种有价值的化学品进行分离断然。

1.3 多酶级联反馈中的辅酶再生

辅酶是一大类有机辅助因子的总称，是酶催化氧化规复反馈、基团鼎新和异构化反馈的必需因子，它们在酶催化反馈中承担传递电子、原子或基团的功能。常见的辅酶有硫胺素、烟酰胺、核黄素、吡哆醛过火滋生物、三磷酸腺苷(adenosine triphosphate， ATP)、泛酸和叶酸等，大部分辅酶如NADPH等价钱较为娴雅。为了进一步镌汰老本，多酶级联催化反馈过程中过去需要达成辅酶的再生，其中烟酰胺类辅酶和ATP的再生应用最为过去。

1.3.1 烟酰胺类辅酶再生

烟酰胺类辅酶主要包括氧化型辅酶NAD+、NADP+及相应的规复态辅酶NADH和NADPH 4种。烟酰胺类辅酶价钱相对娴雅，且沉稳性差，是认为了镌汰经济老本和提高蓄意产物的产率，过去需要构建辅酶轮回系统。同期，关于一些存在均衡反馈设施的级联体系，构建辅酶再生系统也有助于促进反馈均衡的正向出动。

笔据所需辅酶类型的不同，又分为再生规复型辅酶(图 10A)和再生氧化型辅酶(图 10B)两类。常用于规复型辅酶NAD(P)H再生的酶主要有醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase， ADH)[86]、葡萄糖脱氢酶(glucose dehydrogenase， GDH)[87-89]、甲酸脱氢酶(formate dehydrogenase， FDH)[90-92]、亚磷酸脱氢酶(phosphite dehydrogenase， PDH)[93-95]等。在骨子应用中，需要笔据辅酶轮回效劳和通盘级联反馈体系的适配性，从而采纳最优的辅酶轮回系统。现在常用的氧化型辅酶NAD(P)+再生体系主要有乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase， LDH)[96]、NAD(P)H氧化酶[(NAD(P)H oxidase， NOX][97-98]、谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase， GluDH)[99]、羰基规复酶(carbonyl reductase， KRED)[100]等。

由于级联体系中过去波及多个辅酶再生系统，存在互相竞争关系，常用的科罚计策是采纳辅酶偏好性不同的辅酶再生系统。在2018年，笔者场所课题组东说念主工瞎想了一种新式的多酶级联反馈催化环烷烃的C‒H键胺化体系(图 11)[15]。该级联反馈系统主要由3种酶组成，区别是单加氧酶P450BM3突变体、来自腔肠链霉菌(Streptomyces coelicolo)的醇脱氢酶ScADH和来自西伯里克西果菌(Exiguobacterium sibiricum)的亮氨酸脱氢酶突变体EsLeuDH，在该体系中，作家将第一步羟基化反馈所需的双辅酶偏好性的葡萄糖脱氢酶更换成单一NADP+偏好性的木糖醇脱氢酶，以幸免其对后续借氢级联设施的扰乱。最终反馈48 h后，产物环己胺的滴度达到12.8 mmol/L，产物采纳性高达87.4%。Sattler等[101]在一锅多酶级长入成6-氨基己酸的反馈中，也诈欺了一样的计策，从环己醇到己内酯合成过程所用的醇脱氢酶和单加氧酶为NADP(H)依赖性，而从己内酯到6-氨基己酸合成过程所用的醇脱氢酶为NAD+依赖性，从而灵验地幸免了两个反馈的辅酶竞争和扰乱。

1.3.2 三磷酸腺苷ATP的再生

由于ATP价钱娴雅，无法在多酶催化过程中多数添加，因此需要构建ATP再生体系。现在用于ATP再生的激酶主要有3-磷酸-甘油酸激酶(3-phosphate-glycerate kinase， 3-PGK)、乙酸激酶(acetate kinase， AK)、丙酮酸激酶(pyruvate kinase， PK)、肌酸激酶(creatine kinase， CK)、多磷酸激酶(polyphosphate kinase， PPK)、腺苷酸激酶(adenylate kinase， ADK)和氨基甲酸激酶(carbamate kinase， CBK)等(图 12A)。其中PK催化所需的辅底物价钱较高，CBK的沉稳性差，应用较少；而AK由于具有辅底物老本低和沉稳性高等优点，应用较多。举例，默克和Codexis公司合作瞎想一锅9酶3步法合成抗艾滋病药物islatravir[32]的案例中，等于利用AK进行ATP再生。ADK由于辅底物亦然ADP，无需其他辅底物，也常用于ATP再生，且常和多磷酸激酶(PPK2-Ⅱ)或多磷酸AMP磷酸鼎新酶(polyphosphate AMP phosphotransferase， PPT)进行级联用于ADP/AMP轮回(图 12B)。

PPK沉稳性最好，所需的辅底物多聚磷酸盐老本最低，着手过去。PPK主要分为PPK1和PPK2两大类(表 1)。其中PPK1合成ATP标的的Keq低，热沉稳性好，已有多个不同着手的PPK1用于体外ATP再生。举例，着手于E. coli的PPK1用于再生ATP，以从甲氧戊酸合成阿莫菲二烯[102]以及从丁二酸和甘氨酸合成5-氨基乙酰丙酸[103]。着手于细长热合胞球菌(Thermosynechococcus elongatus， TePPK)的PPK1酶热沉稳性好，已顺利应用于合成D-氨基酸二肽[104]和谷胱甘肽[105]。

由于PPK2合成ATP标的的均衡常数Keq高、催化效劳高以及分子量小，是以应用更为过去。PPK2又不错分为3小类：PPK2-Ⅰ、PPK2-Ⅱ和PPK2-Ⅲ。PPK2-Ⅰ的底物是ADP。举例，在γ-谷氨酰胺合成酶催化谷氨酸钠和乙胺盐酸盐合成L-茶氨酸的反馈中，着手于浑球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)的PPK2-Ⅰ用于从聚磷酸盐再生ATP[106]。PPK2-Ⅱ的底物是AMP，由于PPK2-Ⅱ酶是AMP的磷酸化，它们必须与腺苷酸激酶(adenylate kinase， ADK)或其他PPKs一说念责任以达成ATP再生(图 12B-Ⅱ， Ⅲ， Ⅳ)，举例，来自约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)的ADK和PPK2-Ⅱ已被用于ATP再生[107]。2019年，Strohmeier等[108]在需要NADPH和ATP当作辅酶的羧酸规复酶催化胡椒酸体外规复反馈中，利用PPK2-I和PPK2-Ⅱ催化由AMP再生ATP。同期，PPK2-Ⅱ专有的AMP再生特质在某些情况下相等有用，如利用羧酸-辅酶A都集酶将辅酶A (CoA)再生为酰基辅酶A (acyl-CoA)时需要ATP，开释AMP，其中A. johnsonii PPK2-I和窦根瘤菌(Meliloti Sinorhizobium) PPK2-Ⅱ协同催化可达成由AMP再生ATP[109]。PPK2-Ⅲ的底物既不错是ADP，也不错是AMP，是以PPK2-Ⅲ也大要通过达成从AMP合成ATP，其效果等同于PPK2-Ⅱ和PPK2-Ⅰ或ADK章程级联催化AMP合成ATP (图 12B-Ⅴ， Ⅵ)。举例，来自溶卵白芽球菌(Deinococcus proteolyticus)的PPK2-Ⅲ被用于将AMP再生为ATP，该酶被用于与酪氨酸合成酶偶联以合成氨基酰脯氨酸[110]。

2 多酶级联催化合成双官能团化学品的应用进展

跟着减少环境浑浊和对可握续性发展意志的提高，全球对双官能团化学品的需求冉冉增多。常见双官能团化学品有ω-氨基脂肪酸(ω-amino fatty acids， ω-AFAs)、烷基内酰胺(alkyl lactams， ALs)、α， ω-二元羧酸(α， ω-dicarboxylic acids， α， ω-DCAs)、α， ω-二胺(α， ω-diamines， α， ω-DMs)、α， ω-二醇(α， ω-diols， α， ω-DOs)和ω-氨基醇(ω-amino alcohols， ω-AOs) (图 13)。其中ω-AFAs、ALs、α， ω-DCAs和α， ω-DMs可当作尼龙的迫切单体，α， ω-Dos是合成聚酯和聚氨酯的单体，ω-AOs在医药中间体以及香料、润肤剂和增塑剂中有着过去的应用，因此它们都具有宽广的商场需求。以碳原子个数为6的化学品为例，6-氨基己酸和己内酰胺是尼龙6 (全球每年近700万t)的单体，己二酸和1， 6-己二胺是尼龙66的单体，1， 6-己二醇是合成聚酯、聚氨酯、黏合剂和不足够聚酯的材料，6-氨基己醇由于同期具有羟基和氨基，具有醇和胺的通性，是一种用途过去的医药中间体。

2.1 多酶级联催化合成α， ω-二元羧酸

脂肪族α， ω-二元羧酸(α， ω-DCAs)是一类过去用于制备香料、尼龙、黏合剂和大环内酯类抗生素的化学品[116-117]，主要通过化学法、生物发酵法、多酶级联催化法合成。其中化学合成法以环己烷为肇端原料在薄情要求下进行两步化学氧化合成[118]，生物发酵法例是通过矫神圣肠杆菌内的代谢途径合成己二酸，主要以葡萄糖[119-124]、甘油[125]、纤维素[124]等为肇端原料，其代谢合成武艺最高达68 g/L[123]。比较于生物发酵法，多酶级联催化法可灵验幸免竞争性代谢途径、幸免物理防碍和毒性问题，不错为非自然产物构建新合成途径。湖北大学李爱涛课题组顺利瞎想了大肠杆菌菌群一锅法生物催化环烷烃合成α， ω-二元羧酸[126]，比较于发酵法，该步调的α， ω-二元羧酸产物(C5–C8)滴度昭彰更高，如戊二酸(1.6–6.3 g/L vs. 0.82 g/L)[127]和辛二酸(1.1–7.3 g/L vs. 0.254 g/L)[128]，己二酸居品滴度高达66 g/L，与文件报说念的最高值(68 g/L)相等[123] (表 2)。

2.2 多酶级联催化合成ω-氨基脂肪酸和烷基内酰胺

ω-氨基脂肪酸(ω-AFAs)是一类迫切的脂肪酸滋生物，具有α-羧基和ω-氨基2个官能团，是一类迫切的聚酰胺合成单体，可进一步缩合生成聚酰胺(polyamide)，是尼龙(nylon)的迫切单体，具有过去的应用价值。现在，科研东说念主员照旧顺利构建了多条生物催化级联途径用于合成ω-氨基脂肪酸和烷基内酰胺(表 3)，主要聚拢于尼龙6、尼龙11和尼龙12单体的合成。

早在2014年，Sattler等[101]构建了多酶级联反馈旅途，以环己醇当作开赴底物，在只须耗氧气和氨气的要求下合成尼龙6单体6-氨基己酸。该合成途径不错达成辅因子的自力壮盛，从环己醇生产ε-己内酯，随后进一步合成6-氨基己酸(图 14A)，但是产率只要1%。商量发现6-羟基己酸对醇脱氢酶存在禁锢作用，通过“羧基封端计策”，以最大限制地减少中间体6-羟基己酸的变成。利用此计策，前体ε-己内酯在存在甲醇的水性介质中被振荡为相应的甲酯，而不是酸。同期，初度标明马肝酯酶不错催化ε-己内酯的采纳性开环，况兼昭彰偏好甲醇而不是水当作亲核试剂。当底物环己醇浓度为50 mmol/L时，尼龙单体的产率提高到了24%。该途径为生物酶法催化环己醇合成尼龙6单体开辟了先河，但是产率依然较低，可能是因为甲醇对单加氧酶有禁锢作用。

2020年，Fedorchuk等[135]以己二酸为底物，建筑了一锅酶法级联反馈体系，利用羧酸规复酶(CARs)和转氨酶(TAs)催化10 mmol/L己二酸合成6-氨基己酸的产率高达95% (图 14B)。该途径中将CAR进行分子矫正，使其对6-氨基己酸的催化效劳权臣提高，同期筛选多数的TAs，将6-氨基己酸到己二胺的途径也顺利买通。但是己二胺的产率依然较低(30%)，同期为了幸免反馈过程中产生副产物，通盘酶制剂均遴选纯酶的体式进行催化，导致操作经由复杂，生产老本过高，且底物上载量只要10 mmol/L，远远够不上工业化生产的要求。

烷基内酰胺当作尼龙(nylon)的迫切单体，现在工业化合成尼龙单体主如果利用化学法以环己醇为底物经4步催化合成己内酰胺(图 15A)，但是该化学合成途径具有反馈要求薄情、环境浑浊大、副产物多等漏洞，在工业应用中存在收尾[136]。生物法合成烷基内酰胺的常用计策是先合成ω-氨基脂肪酸，然后酶促ω-氨基脂肪酸环化合成烷基内酰胺。2021年，韩国开国大学Yun等[134]以环烷基胺为底物，构建了一个智能的辅酶/副产物轮回体系，用于高效合成尼龙单体ω-氨基脂肪酸和烷基内酰胺(C=4， 5， 6) (图 15B)。由于临了一步的环化酶是限速设施，作家通过筛选对ω-氨基脂肪酸催化效劳高的环化酶并进一步矫正，随后对该级联过程中的酶进行共抒发，利用全细胞高效催化合成ω-氨基脂肪酸和烷基内酰胺，产率区别达到96%和74%。该级联途径具有不添加辅酶和产率高等优点，但是依然存在着底物环烷基胺价钱娴雅等问题。

2021年，韩国开国大学Yun团队又开辟了一种以环己醇为底物，遴选基于单位的模块化计策，利用全细胞菌群催化环己醇生产6-氨基己酸和ε-己内酰胺(图 16)。该途径是一个具有高原子经济性和辅因子自力壮盛的多酶级联生物催化系统[52]，无需迥殊添加辅酶。瞎想的每个模块对应一个大肠杆菌细胞，然后利用菌群配合催化100 mmol/L环己醇合成6-氨基己酸，6-氨基己酸得率进步97%，进一步偶联环化设施可生成28%的己内酰胺。该途径具有底物价钱低，6-氨基己酸产率高等上风，但是依然存在着级联设施复杂和环化效劳低等问题。

2.3 多酶级联催化合成α， ω-二醇和ω-氨基醇

除了上述尼龙单体，双官能团化学品还有α， ω-二醇(α， ω-DOs)和ω-氨基醇(ω-AOs)。α， ω-Dos可当作聚酯和聚氨酯的单体，ω-AOs在散装化学品以及香料、润肤剂和增塑剂中有着过去的应用。近10年来多个商量团队戮力于于利用多酶级联催化反馈合成α， ω-二醇和ω-氨基醇(表 4)，并取得了一定的恶果。

最近，Yun等[47]将胺化设施当作菌群中的一个基本模块(胺化模块：Cell-Am)用于将底物的结尾羟基振荡为氨基，基于此报说念了一种多细胞菌群催化合成生物塑料单体的多酶级联反馈系统(图 17)[48]。除了胺化模块外，还有2个其他功能细胞模块，包括将脂肪酸甲酯(fatty acid methyl ester， FAME)振荡为ω-羟基脂肪酸(ω-hydroxy fatty acid， ω-HFA)的羟基化模块(Cell-Hm)和将脂肪酸的羧基振荡为羟基的规复模块(Cell-Rm)。随后以蓄意产物为导向，对这些细胞模块进行拼装，配合不同参数的优化，一锅法催化不同碳链长度(C8、C10和C12)的脂肪酸甲酯合成ω-氨基脂肪酸、α， ω-二醇、ω-氨基醇和α， ω-二胺，其中12-氨基脂肪酸和1， 12-二醇的分离得率区别为66.5%和52.5%。

2016年，新加坡国立大学李智团队一样通过模块化级联计策对烯烃进行高度区域和对映采纳性地多重氧化和氨基官能化[16] (图 18)。作家领先顺利瞎想了4个不同功能的细胞模块，第1个模块包含环氧化物酶(epoxidase， EP)和环氧化物水解酶(epoxide hydrolase， EH)，将结尾烯烃水解为1， 2-二醇；第2个模块包含醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase， ADH)和醛脱氢酶(aldehyde dehydrogenase， ALDH)用于将1， 2-二醇结尾双氧化为α-羟基酸；第3个模块包含ADH、ω-转氨酶(ω-transaminase， ω-TA)和丙氨酸脱氢酶(alanine dehydrogenase， AlaDH)用于将1， 2-二醇氧化转氨为1， 2-氨基醇；第4个模块包含羟基酸氧化酶(hydroxy acid oxidase， HO)、α-转氨酶(α-transaminase， α-TA)、过氧化氢酶(catalase， CAT)和谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase， GluDH)，用于将α-羟基酸氧化转氨为α-氨基酸。将每个模块的酶都顺利地在归并个质粒上共抒发，且将模块中的基因克隆到其他3个不同的常用质粒上抒发，比较其催化效劳。将模块1和模块2进行组合和抒发优化，催化120 mmol/L模式底物苯乙烯合成α-羟基酸，22 h内α-羟基酸的振荡率为78% (98% ee)。以一样的方式将模块1和模块3进行组合，催化60 mmol/L苯乙烯合成1， 2-氨基醇，12 h内1， 2-氨基醇的振荡率为70% (98% ee)。一样，将模块1_2和模块4进行组合和优化，催化60 mmol/L苯乙烯合成α-氨基酸，24 h内α-氨基酸的振荡率为80%。

2020年，湖北大学李爱涛课题组从新瞎想了包含3个模块化菌群，达成一锅多酶级联催化环己烷合成1， 6-己二醇[137]。基于氧化规复自力壮盛，将参与生物催化级联的通盘酶都散布在3个基本细胞模块中，每个模块中的酶都在一个细胞中共抒发，然后3个细胞组成菌群协同催化合成1， 6-己二醇(图 19)。需要指出的是在模块3的临了一步催化过程中，不同于平直利用细胞的内源性醛脱氢酶将醛规复为醇，该处是利用腐化假单胞菌(Pseudomonas putida)着手的醛酮规复酶PpAKR与葡萄糖脱氢酶(BmGDH)[88]介导的NADPH再生偶联将醛规复为醇。通过组合模块菌群2_3催化20 mmol/L环己醇高效合成16–18 mmol/L的1， 6-己二醇，组合模块菌群1_2_3催化30 mmol/L环己烷顺利合成13 mmol/L的1， 6-己二醇，并进一步将底物谱拓展至不同碳原子数(C5–C8)的环烷烃。

不同于上述多酶级联催化合成某个特定的二元醇，2022年西湖大学曾安对等[138]瞎想了一条4酶(氨基酸羟基酶、L-氨基酸脱氨酶、α-酮酸脱羧酶和乙醛规复酶)章程级联催化途径催化振荡6种不同的氨基酸(缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、戊氨酸、正亮氨酸和苏氨酸)，顺利合成了10种不同的二醇，其中有6种二醇是利用生物法初度合成。

2.4 多酶级联催化合成α， ω-二胺

尼龙是咱们日常生存中最基本和最过去使用的材料之一，2020年全球年产量已达到970万t，α， ω-二胺[143]和α， ω-二元羧酸是合成聚酰胺(也称为尼龙)的单体[123]，如己二胺和己二酸当作尼龙66的单体。表 5追忆了现在多酶级联催化不同底物合成α， ω-二胺的商量进展。

早在2012年，奥地利格拉茨大学的Kroutil等[144]顺利构建了氧化规复自力壮盛的伯醇胺化反馈旅途，主如果利用醇脱氢酶和转氨酶级联将伯醇胺化，同期利用丙氨酸脱氢酶构建自力壮盛的辅酶再生系统，两次胺化即可将α， ω-二醇振荡为α， ω-二胺，但是存在底物禁锢和产物过氧化等问题。2018年，Yun等[47]创造性地发明了两步级联法将醇胺化产生ω-氨基脂肪酸和α， ω-二胺(图 20)，与上述途径不同的是，该途径中作家引入了新颖的平行反义级联(氨基供体苄胺逆向脱氨最终振荡为羟基)该途径中领先筛选赢得来自集胞藻属(Synechocystis species)的NAD(P)+依赖性醛规复酶SsAHR和着手于硅酸杆菌(Silicibacter pomeroyi)的ω-转氨酶PMTA，利用SsAHR和PMTA在单细胞中共抒发催化ω-羟基脂肪酸合成ω-氨基脂肪酸，并将底物谱拓展至C6–C16，底物浓度也提高至200 mmol/L，均取得了较高的胺产率。随后，利用此级联体系催化振荡100 mmol/L的α， ω-二醇(C8–C14)，经过2次胺化顺利合成α， ω-二胺(C8–C14)，产物二胺浓度最高达88 mmol/L。临了，通过勾搭内酯酶催化100 mmol/L ε-己内酯顺利合成80 mmol/L的6-氨基己酸。

3 追忆与瞻望

与传统发酵生产比较，多酶级联催化合成化学品上风相等昭彰，功能可控性强，反馈要求易限定，居品滴度更高。跟着多种不同酶催化剂过火新功能的握住发现，越来越多的多酶级联体系被顺利构建。但是现在大多数多酶级联反馈仍处于实验室阶段，底物上载量低，催化体系小，合收效劳无法达到大限制生产的需求。其中主要的原因在于所需元件酶的沉稳性和催化效劳等仍需进一步提高，如BVMO单加氧酶和P450羟化酶等常常成为级联反馈的限速酶。枯竭级联反馈途径中的要道酶，尤其是合成机制复杂尚未报说念的酶元件亦然多酶级联反馈的一个要道瓶颈。当级联反馈体系过于复杂时，酶的抒发调控烦嚣，催化体系的兼容性更具挑战，反馈体系中多个底物、辅因子对酶催化效劳的影响更大。

自2018年阿诺德教师因在定向进化方面的了得责任获诺贝尔奖以来，全宇宙多个实验室都在尝试利用定向进化等技艺技巧以赢得具备特定功能的酶元件巨乳 露出，从而为多酶级联体系的构建提供更丰富的器具箱。2020年，AlphaFold的横空出世，通过酶的氨基酸序列精确预测卵白三维结构，为酶的感性瞎想开放了新的大门。近些年来发展的辅酶再生技艺日渐锻真金不怕火，多酶会通卵白技艺以及菌群催化技艺得到了进一步完善和应用，使多酶级联反馈老本的进一步镌汰成为可能。翌日应长远商量多酶催化反馈能源学和热力学并建筑对应的数学模子[87]，将多酶级联途径瞎想与策划相勾搭，果然达成表面指示践诺。

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